促进GTP释放的选择性激动剂可延长阿片类镇痛药的疗效

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-025-09880-5

原文作者：Edward L. Stahl, Matthew A. Swanson, Vuong Q. Dang, Michael D. Cameron, Nicole M. Kennedy, Thomas D. Bannister, Laura M. Bohn

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摘要 (Abstract)

G蛋白偶联受体（GPCRs）作为鸟苷酸交换因子（GEFs），通过将GDP替换为GTP来促进三聚体G蛋白的激活¹。这种交换功能并非单向的²。在此，我们证明激动剂可以对偏好GTP释放的活性状态表现出选择性亲和力。具体来说，对于μ阿片受体（MOR），我们发现几种激动剂在促进GTP释放与GTP结合方面表现出状态选择性亲和力。我们鉴定出两种激动剂对促进GTP释放表现出明显的偏好。在小鼠模型中，微量有效剂量的释放偏好性激动剂增强并延长了吗啡和芬太尼的抗伤害感受作用，但并未增强芬太尼的呼吸和心脏作用。尽管这些观察仅限于简单的热伤害感受测量，但它们可能指明了一种区分此类激动剂生理反应的方法。我们提出，激动剂的活性状态选择性可能决定了受体GEF功能的优选方向，这可能会影响受体与下游效应器结合的动力学和选择性；这最终可能提供一种解耦由药物诱导的多方面生理反应的手段。

正文 (Main)

三聚体G蛋白通过调节GTP的结合和水解来传递信息给细胞内伴侣³。G蛋白通过与GPCRs和效应器的相互作用，提供必要的信息传递的转导功能^4,5。三聚体G蛋白由一个与β和γ亚基二聚体结合的α亚基组成；当α亚基与GDP结合时，它们保持三聚体结构⁶。受体为细胞外激动剂和细胞内G蛋白转导器之间的信号提供了跨膜通路⁷。具体而言，GPCRs会发生构象变化，催化受体与Gα蛋白之间的反应^8,9,10。这种相互作用将Gα结合GDP的亲和力转变为有利于GDP释放和GTP结合的条件³。因此，受体充当GEF，该反应被认为是主要的单向过程¹¹（图1a）。然而，有观察表明受体的GTP加载功能是可逆的——即受体可能促进GTP从Gα的释放。早期关于这种可逆相互作用的例子使用了不可水解的GTP形式，如GTPγS^3,12，其中观察到激动剂结合受体后放射性标记的GTPγS的解离。其中一项研究检查了表达MOR的细胞中$^{35}$S-GTPγS释放的动力学，发现核苷酸释放的速率随单一饱和浓度激动剂浓度的增加而增加，并且部分和完全激动剂在两种交换反应中都保持了其功效的等级顺序¹³（$^{35}$S-GTPγS 结合和 $^{35}$S-GTPγS 释放）。

在此研究中，我们调查了释放机制作为激动剂浓度的函数的重要性及其如何影响体内药物反应性。在链接的文章¹⁴中，我们对释放反应进行了广泛的药理学和生化表征，我们将其总结在三态耦合模型中（图1a）。在该研究中，我们表明受体的GTP释放功能遵循与受体GTP结合功能相关的药理学原理。总而言之，释放功能依赖于激动剂浓度，可通过拮抗剂逆转，且在正交激动剂和拮抗剂之间保留竞争性相互作用。此外，我们证明该效应是由于受体群的激活，而不仅仅是受体占有率的函数。我们提供了实验证据和一个功能状态模型，证明激动剂促进GTP释放的功效和效力可能与其诱导GTP结合的功效和效力不同。因此，激动剂可能表现出对G蛋白功能性活性状态平衡的影响的选择性，并可能对其中一个状态表现出偏好。我们还提供证据表明，激动剂对GPCRs交换功能的两种状态可能具有不同的效力等级和功效。

在本研究中，我们表明激动剂可以以浓度依赖性方式诱导Gα蛋白的GTP结合和GTP释放，并且对于几种不同的GPCRs可以观察到这一点（图1）。GTP结合是通过常规方法评估的，该方法涉及在存在$^{35}$S-GTPγS和递增浓度的激动剂的情况下孵育分离的细胞膜^15,16。为了观察GTP释放，我们使用了一种“脉冲-追踪”范式，该范式首先用$^{35}$S-GTPγS加载膜制剂。由于许多GPCRs受到钠离子的负向调节，去除钠离子可以使所有敏感受体处于组成性激活状态，并随后加载$^{35}$S-GTPγS结合到G蛋白上。脉冲后，追踪阶段涉及稀释膜，并在存在钠的情况下加入过量的未标记（冷）GTPγS（参见方法）。

两种反应在图1b中使用过表达小鼠MOR的细胞制备的膜进行比较。数据以结合和释放测定法的放射性计数表示；为了便于比较效力，数据也相对于基线（0%）和每种反应中使用的最高浓度（100%）进行了标准化，并且释放功能的曲线是反转的。对于MOR，DAMGO（[D-Ala₂, N-MePhe₄, Gly-ol]-脑啡肽类似物）的效力在两种测定中都保持不变，甲硫脑啡肽（met-enkephalin）也是如此（图1c）。在Kappa阿片受体（KOR）、血清素1A受体（5-HT_1AR）上的二苯并环庚啶A（dynorphin A (1–17)）、毒蕈碱2受体（M₂R）上的胆碱能激动剂（carbachol）以及生长抑素2受体（SST₂R）上的生长抑素-14（SST-14）中也可以观察到交换效应（图1d–g）。值得注意的是，MOR和M₂R上的激动剂效力在两个状态下保持不变，而二苯并环庚啶、血清素和生长抑素在其同源受体上促进GTP释放的效力要高得多（图1h；单个曲线见扩展数据图 1）。

临床上相关的阿片类激动剂具有广泛的药理学特征（包括部分激动剂和偏倚激动剂）；因此，我们使用这些工具化合物来确定释放功能和结合功能是否可以在MOR上分离。此外，我们测试了两种新化合物，它们是根据我们实验室引入的偏倚性MOR激动剂的支架变化（SR系列，例如 SR-17018）选择的，并且其特点是作为完全激动剂，在细胞实验中效力低于吗啡。后者的考虑是基于不希望在科学文献中引入更多高效力的阿片类激动剂。对于每种药物，DAMGO平行进行测定作为参考，因为DAMGO在两种反应中保持相同的效力，并在此细胞系中定义两种测定的最大功效。不出所料，一些激动剂的表现与DAMGO相似，在两种反应中都保持了效力；然而，一些激动剂对一个状态比另一个状态表现出差异性的效力偏好（图2a）和/或功效偏好（图2b）（参见扩展数据图 2 获取曲线，扩展数据表 1 获取参数）。由于这两种效应是与DAMGO平行测量的，我们也确定了每种激动剂在释放测定和结合测定中转导效率的差异（ΔΔlogR；图2c和扩展数据表 1）。这种表示允许在反应之间进行归一化，以直接比较激动剂活性¹⁷。这两种新激动剂在释放功能上显示出显著的增益，相对于转导效率的差异，它们对释放活性状态的选择性提高了近百倍；我们将这些化合物命名为 muzepan1 和 muzepan2（图2d），因为它们是含有“氮杂环庚烷”（'azepane'）环的μ阿片受体作用化合物。

先前已将几种表现出状态偏好的激动剂识别为偏倚激动剂，它们偏好G蛋白信号传导而非β-arrestin2募集（例如，oliceidine¹⁸、PZM21¹⁹、herkinorin²⁰、丁丙诺啡^21,22,23和SR-17018²⁴）。当在表达人类MOR的细胞测定中进行测试时，我们用于评估SR-17018偏倚激动剂活性²⁴的测定时，muzepan1和muzepan2在GTPγS结合和β-arrestin2募集之间均未显示偏好（扩展数据图 3a 和扩展数据表 2）。此外，在人类受体上保持了对GTP释放相对于结合的交换选择性（扩展数据图 3b，扩展数据表 3）。因此，虽然许多表现出相对于结合的释放选择性的化合物也表现出相对于$eta$-arrestin2募集的G蛋白结合偏好，但这种相关性并非绝对的。

为了证明激动剂诱导的GTP释放的生理学意义，实验在小鼠脊髓膜中重复进行。在结合实验中，DAMGO仅在天然组织中促进约40%的刺激（（1.4 ± 0.01）倍；P < 0.001，与基线配对 t 检验；扩展数据图 4a）。我们确定钠离子缺乏的条件导致非常高水平的GTPγS结合，使得难以观察到DAMGO对释放的影响。这是可以预期的，因为系统中MOR的水平相对较低，如结合研究中约40%的刺激所反映的（扩展数据图 4a）。因此，为了分离MOR可及的G蛋白库，我们在脉冲阶段使用钠和$^{35}$S-GTPγS存在下使用DAMGO，并在追踪阶段稀释100倍（方法和参考文献¹⁴）。我们证明了这在CHO-mMOR细胞系中是可行的，其中DAMGO的效力与钠离子缺乏的加载条件相似，尽管释放功能的效力略有降低（结合力19 nM vs 释放力43 nM；P < 0.05，t 检验；扩展数据图 4b）。在小鼠脊髓膜中，当在预处理期间包含100 nM DAMGO时，$^{35}$S-GTPγS加载增加约10%（P < 0.001；配对 t 检验），但在MOR敲除小鼠的脊髓中没有观察到变化（扩展数据图 4c）。因此，我们将这种温和的刺激视为小鼠脊髓中MOR介导的GTPγS加载的代表。

在小鼠脊髓膜中，DAMGO 在刺激 $^{35}$S-GTPγS 结合方面比 muzepan1 和 muzepan2 效力更高，而所有激动剂都是完全激动剂（图3a）。在释放范式中，DAMGO 效力下降，而 muzepan1 和 muzepan2 效力增加（图3b）。值得注意的是，muzepan1 和 muzepan2 获得的功效达到了脉冲加载中预期的 10% 最大效应（扩展数据图 4c）。这与 DAMGO 形成了对比，DAMGO 没有达到这个平台，这表明在脊髓中，这种脑啡肽样激动剂可能对释放具有选择性。在 MOR 敲除小鼠的脊髓膜中未观察到显著效果（扩展数据图 4d）；因此，这些效应很可能是由于 MOR 激活引起的。

在小鼠中，muzepan1 和 muzepan2 可以穿过血脑屏障，在腹腔注射 3 mg kg⁻¹ 化合物后 1 小时可在脑中检测到（muzepan1: 463 ± 83 nM，muzepan2: 493 ± 187 nM，n = 3；扩展数据图 5a）。因此，我们在热板试验和温水浸尾试验中测试了这些化合物的抗伤害感受功效，并与吗啡进行了比较（图4a）。通过 1 小时效应确定的效力与其在GTPγS结合（以及释放）中的等级顺序效力相关，尽管我们注意到，在高剂量下，muzepan1 在 4 小时测试持续时间内的功效几乎达到最大（图4b）。值得注意的是，所有激动剂在 MOR 敲除小鼠中均无作用（图4b,c；吗啡见参考文献²⁴）。

为了确保这些化合物不是通过与吗啡代谢（通过葡萄糖醛酸化发生²⁵）竞争来间接增强吗啡的作用，我们还使用了通过 CYP3A4 代谢的芬太尼²⁶。值得注意的是，通过体外竞争研究确定，这两种化合物均不与 CYP3A4 竞争（muzepan1: 在 10 µM 时抑制 11%，muzepan2: < 10% 抑制；扩展数据图 5b）。虽然使用吗啡只测试了雄性小鼠（由于吗啡代谢和敏感性存在性别差异²⁷），但由于我们测量的反应在性别之间具有可比性^24,28，因此对雄性和雌性小鼠都测试了芬太尼。当组合使用时，muzepan1 在随时间延长芬太尼的功效方面表现出比两种化合物的预测叠加效应更大的延长作用（图5d；参见扩展数据表 4 以获取图 5 中所有时间进程数据的双因素重复测量方差分析结果）。

值得注意的是，muzepans 对阿片类药物诱导的抗伤害感受作用的影响类似于向 MOR 激动剂添加阳性别构调节剂。因此，我们测试了 muzepan1 是否可以通过测量其对芬太尼诱导的脊髓膜中GTPγS结合的浓度依赖性影响来作为别构调节剂发挥作用。由于我们没有观察到芬太尼效力的左移，我们无法得出结论 muzepan1 在 MOR 上表现为阳性别构调节剂（扩展数据图 7）。

虽然增强镇痛阿片类药物的镇痛作用是可取的，但增强与这些激动剂相关的呼吸抑制和心动过缓则是不希望的。因此，我们...

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